文献类型：学位论文

中文题名：锰离子和N，N-二甲基甲酰胺诱导里氏木霉高产纤维素酶的机制研究

作者：陈雨蒙[1];

机构：[1]华东理工大学;

导师：魏东芝;华东理工大学|沈亚领;华东理工大学|王玮;华东理工大学

授予学位：博士

语种：中文

中文关键词：里氏木霉;纤维素酶;锰诱导;钙信号;DMF诱导;DMF降解

摘要：里氏木霉(Trichoderma reesei)是具有优异蛋白表达能力、分泌能力的丝状真菌,是工业上生产纤维素酶的重要菌株,所生产的纤维素酶已经广泛应用在饲料、制浆造纸、纺织洗衣和生物能源等行业。因此,需要通过现代生物工程技术进一步提高纤维素酶的产量和降低纤维素酶的生产成本,以满足日益增长的商业化需求。此外,T.reesei全基因组测序已经完成、高效的分子生物学和遗传操作体系已经建立和完善,T.reesei日渐成为潜在的研究纤维素酶高产机理、信号转导调控机制的模式菌株和表达异源蛋白质的宿主。为了研究纤维素酶高产机理和信号转导调控机制,本文从以下三个方面开展研究。1)锰离子(Mn2+)诱导纤维素酶高产的机制研究。本研究发现在T.reesei的培养基中添加10 mM Mn2+能够显著提高纤维素酶酶活以及总蛋白分泌量2倍以上。为了研究Mrn2+诱导纤维素酶高产的机制,本研究通过电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定胞内外锰离子含量,鉴定了两个锰转运蛋白,分别命名为TPH084-1和TPH084-2,负责将胞外的Mrn2+运输到胞内,且结果表明它们参与Mn2+诱导的纤维素酶上调。通过Fluo-3 AM钙离子荧光探针实验发现,Mn2+处理能够显著提高胞内钙离子(Ca2+)的浓度,这可能是Mn2+诱导纤维素酶产量显著提高的关键原因。利用LaCl3阻断质膜钙通道,敲除crzl(钙调磷酸酶响应的锌指转录因子)基因,阻断钙信号通路实验,均证明Mn2+通过钙通道和钙信号通路诱导纤维素酶表达。最终,本论文鉴定了钙/锰P-type型ATP酶TPMR1,负责T.reesei细胞中的Ca2+/Mn2+平衡作用。在10mM高浓度Mn2+条件下,TPMR1发挥Ca2+/Mn2+交换的功能,将Ca2+泵入细胞,导致胞内Ca2+浓度迅速升高,激发下游钙信号通路诱导纤维素酶高产。本研究首次发现并揭示Mn2+诱导纤维素酶高产的机制,也为后续研究纤维素酶高产机理及钙信号通路提供理论依据。2)N,N-二甲基甲酰胺(DMF)诱导纤维素酶表达和分泌的机理研究。DMF是一种常见的有机溶剂,被广泛应用在工业中,特别是在生物实验中作为各种不溶于水的底物的溶剂。本研究首次发现DMF能显著地诱导T.reesei高产纤维素酶。为了研究DMF诱导纤维素酶高产的机制,本研究通过转录组学分析发现,与胞内钙调控相关的plc-e基因被DMF激活,表明胞内钙信号在DMF对纤维素酶的诱导中起重要作用。利用Ca2+螯合剂EGTA和质膜钙通道阻断剂LaC13,以及敲除crzl基因实验,证明:DMF通过激活T.reesei细胞的钙通道,摄取胞外Ca2+,导致细胞内Ca2+增加,进而激发细胞内钙信号通路,诱导纤维素酶高产。此外,0.5%～2%的DMF还提高了 T.reesei菌丝体的通透性,增加了纤维素酶的分泌。这些结果表明,DMF通过钙信号和细胞通透性提高纤维素酶表达和分泌。最后研究发现,同时添加1%DMF和10 mM Mn2+可以使纤维素酶产量提高4～6倍,超过两种单独处理的效果。结果说明,DMF和Mn2+有协同作用。本研究首次发现DMF诱导纤维素酶高产,并揭示其诱导机制,为后续研究钙信号在纤维素酶生产中的作用提供指导意义。3)利用基因工程改造的TTreesei降解废水中DMF。由于DMF在许多化学工业中被广泛应用,因此会产生大量含DMF的工业废水。DMF既具有肝毒性,也具有致癌性,会危害人类健康。因此,DMF废水处理是必不可少的,但目前未有关于DMF绿色降解的研究报道。本研究发现:TTreesei可以耐受高浓度的DMF溶液(20 g/L);DMF废水仍能诱导T.reesei高产纤维素酶;此外,T.reesei不能降解DMF。因此本研究基于合成生物学手段,以T.reesei为底盘细胞,导入外源DMF降解途径,构建利用和有效处理废水中DMF的工程菌株。首先,基于HPLC技术建立DMF的检测方法。其次,通过GenBank获取DMF降解途径中的关键酶N,N-dimethyformamidase(DMFase),构建异源表达载体CA21T,进而获得能降解DMF的T.reesei工程菌株T.reesei CA21T。最后,在T.reesei CA21T菌株发酵过程中加入DMF废水,在高产纤维素酶的同时降解DMF。将DMF诱导纤维素酶高产与DMF废水绿色降解结合,实现“一箭双雕”。成功构建的T.reesei CA21T菌株可作为一种底盘细胞,广泛用于DMF废水的利用和有效处理。更多还原