文献类型：学位论文

中文题名：高通量筛选及发酵条件优化提高安丝菌素的产量

作者：李娟[1];

机构：[1]华东理工大学;

导师：胡凤仙;华东理工大学

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：珍贵束丝放线菌;AP-3;ARTP;高通量筛选;发酵条件优化;基因重排

摘要：安丝菌素P-3(AP-3)是一种具有高抗肿瘤活性的安莎类抗生素,目前已有多个AP-3的抗体药物偶联物处于临床前研究,以AP-3为基础制成的抗体靶向药物TDM1已经上市。然而,菌种本身产量比较低,发酵条件工艺复杂。本论文从菌种诱变与高通量筛选、发酵条件优化及基因重排等方面进行研究,具体研究如下:1.通过将常温常压等离子体(ARTP)育种技术与高通量化(high through-putscreening)培养筛选技术相结合来改善产AP-3菌种。实验结果表明,ARTP诱变时间设置为90 s时,对现有的珍贵束丝放线菌诱变效果最佳。通过酶标板高通量初筛703株诱变菌,经过摇瓶复筛得到一株高产突变株L-40,其AP-3产量比对照菌提高了 27.3%,突变株经传代6次后,仍比对照菌产量提高22.5%,证明其遗传稳定性较好。2.对ARTP诱变的高产菌L-40的种子培养基组成以及培养工艺进行了优化,使得诱变菌的产量进一步提升了 26.8%,优化后的种子培养基配方为(g/L):葡萄糖10,甘油10,玉米浆5,酵母提取物5,碳酸钙2,pH7.0,种子培养的时间由3天缩短为1天,二级传代优化为一级传代。3.外源氨基酸的添加:在发酵初期添加亮氨酸,缬氨酸以及S-腺苷甲硫氨酸对AP-3生产有促进作用。当分别添加0.5 g/L亮氨酸和缬氨酸时AP-3产量比对照205.3 mg/L分别提高了 8.8%和19.5%,AP-3产量分别为223 mg/L和245 mg/L;当添加0.045 g/L S-腺苷甲硫氨酸时AP-3产量为268.2 mg/L,与对照242.5 mg/L相比提高了 10.6%。4.为了进一步提高AP-3高产菌的产量,开展了基因组重排技术改造珍贵束丝放线菌的遗传性能,提高AP-3发酵水平的研究。首先对AP-3产生菌原生质体制备和融合条件进行初步优化;然后以ARTP诱变得到的高产菌株L-40、L-117、L-506、L-522作为出发亲本进行三轮基因组重排,最终筛选出一株高产融合子G3-96,其AP-3产量约为335.9 mg/L,经三次传代后AP-3产量比亲本提高了 44.5%,比实验室原有的出发菌株提高了 93.8%,且能够稳定遗传。5.通过荧光定量PCR对ARTP诱变后的菌株L-40以及更换种子培养基后的菌株L-40其AP-3合成相关基因的转录水平进行分析,发现在高产菌株中与AP-3合成相关基因都有明显的上调,同时发现一个控制细胞分裂的基因asm6663,它的过量表达会导致菌丝体片段严重。在L-40菌株中asm6663出现了明显下调,镜检结果也显示诱变菌的菌丝成团紧致,这一现象与AP-3的合成呈正相关。