文献类型：学位论文

中文题名：米曲霉表达系统的构建及其在产黄青霉α-淀粉酶表达中的应用

作者：尹燕辰[1];

机构：[1]华东理工大学;

导师：杨胜利;华东理工大学

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：米曲霉RIB40;;PEG-CaCl_2转化;;α-淀粉酶;;产黄青霉

摘要：丝状真菌具有良好的生长特性和分泌大量胞外蛋白的能力,能够将蛋白质前体进行正确加工修饰如糖基化、形成二硫键等,是生产重组蛋白的强大宿主。米曲霉(Aspergillus oryzae)是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种,已有一千多年安全的应用历史,是GRAS级别的安全菌株,能生产多种具有工业应用价值的酶类及次级代谢产物。使用分子生物技术,将基因转化米曲霉能够显著提高基因的表达水平。 本课题建立了适用于米曲霉的PEG-CaCl2介导的原生质体制备方法和重组表达载体的转化方法。使用pBC-hygro作为质粒骨架并进行了改进和优化,连入博来霉素抗性基因表达盒,使用博来霉素作为筛选标记,并通过使用氯丙嗪、TritonX-100成功提高了米曲霉RIB40宿主对博来霉素的敏感性,将博来霉素的使用浓度从200μg/mL降低到100μg/mL。根据报告基因绿色荧光蛋白的表达情况,从三个启动子中筛选强启动子,最终选择米曲霉α-淀粉酶强启动子PamyB作为启动子表达米曲霉同源α-淀粉酶基因amyB,成功得到了酶活提高106.27%的转化子。 本课题通过紫外诱变筛选到了一株pyrG营养缺陷型菌株PF2作为转化宿主。将pyrG筛选标记、α-淀粉酶启动子PamyB、α-淀粉酶终止子TamyB依此连入改良的pBC载体中,构建表达载体pBCPaTP。利用pBCPaTP分别在PF2中表达了来自真核生物的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和来自原核生物变形杆菌属(Proteus sp.)的脂肪酶(Lipase),证明转化系统对于来自原核、真核生物的异源蛋白同样适用。 本课题鉴定了一株产α-淀粉酶的青霉(Penicillium sp.),命名为3-5。通过提取RNA反转录克隆了3-5的α-淀粉酶基因,鉴定为来自产黄青霉(Penicillium chrysogenum)的a-淀粉酶基因并命名为PcAmy。使用米曲霉amyB作为基因carrier以KEX2作为连接linker,构建融合蛋白表达载体pBCPaTPAKah。使用Ni-NTA亲和纯化作用将带有His-Tag标签的PcAmy从发酵液中纯化出来。这是将产黄青霉α-淀粉酶基因首次进行的异源表达,也是米曲霉表达系统中首次表达的青霉属a-淀粉酶基因。