文献类型：学位论文

中文题名：里氏木霉纤维素酶高产菌株遗传改造及纤维素酶转录调控机制研究

作者：刘培[1];

机构：[1]华东理工大学;

导师：赵健;华东理工大学|王玮;华东理工大学|魏东芝;华东理工大学

授予学位：博士

语种：中文

中文关键词：里氏木霉;基因组测序;转录因子;H+-ATPase;糖苷水解酶

摘要：丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）产生的纤维素降解酶在工业上应用普遍。然而纤维素酶的高生产成本仍然是生物燃料商业化销售重大挑战。研究里氏木霉生产纤维素酶的调控机制,对纤维素酶生产菌株进一步人工改造,提高里氏木霉生产纤维素酶的能力,有很强的工业和科研价值。为了更好地对里氏木霉纤维素酶高产菌株遗传改造和对纤维素酶转录调控机制进行研究,本论文主要从以下4个方面研究:1)通过比较基因组分析筛选里氏木霉高产纤维素酶菌株的功能突变位点里氏木霉SS-Ⅱ是一株夏盛公司赠送的纤维素酶高产菌株。SS-Ⅱ与著名的纤维素酶高产菌株RUT-C30均是从亲本菌株NG14通过不同的突变方法筛选而来的。与RUT-C30相比,SS-Ⅱ生长更快,而且生产的纤维素酶对生物质的降解效率更高。本实验对SS-Ⅱ的基因组测序,总共鉴定了 184个SNPs和40个Indels,其中有107个突变不存在于亲本菌株NG14和兄弟菌株RUT-C30,只存在与SS-Ⅱ当中的突变。而且SS-Ⅱ中分解代谢物阻遏因子1（cre1）基因是完整的,没有发生突变。为了结合两个高产菌株RUT-C30和SS-Ⅱ的突变,并获得更高产的菌株,一方面,将RUT-C30中证实的有益突变cre196导入SS-Ⅱ中,得到突变体SS-Ⅱ-cre196,另一方面,在RUT-C30中敲除SS-Ⅱ中受突变影响的基因。由于SS-Ⅱ-cre196中生长的限制,SS-Ⅱ-cre196的总纤维素酶产量反倒降低。相反,在RUT-C30中敲除57个基因,其中31个参与里氏木霉生长或纤维素酶生产,其中五个基因敲除菌株中纤维素酶活性显著增加。与RUT-C30相比,里氏木霉Δ108642和Δ56839的纤维素酶产量分别增加了 83.7%和70.1%。Δ108642菌株对预处理玉米秸秆降解效率提高,葡萄糖产量显著增加了 11.9%。由于遗传背景的差异,在一种纤维素酶高产菌株中证实的有益纤维素酶高产的突变并不总是在另一种纤维素酶高产菌株中有效。基因组重新测序揭示了很多可能影响纤维素酶产生相关的新突变。本部分研究结合两种菌株突变的策略,成功鉴定了许多与纤维素酶生产相关的基因,可用于研究各种基因参与纤维素酶表达的机制。2)里氏木霉RUT-C30中敲除H+-ATPase基因,可在抑制性碳源葡萄糖下诱导纤维素酶高产本研究首先在里氏木霉中鉴定了两种H+-ATPase基因tre76238和tre78757,发挥维持胞内pH稳态的功能。在里氏木霉RUT-C30中敲除这两个基因,证明:tre76238对持胞内pH稳态起主要作用,而tre78757起次要作用。tre76238和tre78757双敲除实验证明,当主要基因tre76238被敲除后,原先起次要作用的基因tre78757成为必须基因,担任其维持胞内pH稳态的功能。实验结果显示,虽然Δ76238菌株的生长速度变慢了,但是Δ76238可以利用纤维素酶抑制性碳源葡萄糖为唯一碳源,生产高水平的纤维素酶,同时Δ76238细胞内的钙离子浓度显著提高。利用细胞膜钙通道阻遏剂LaCl3,封闭Δ76238细胞膜上的钙通道后,Δ76238不能在葡萄糖下产纤维素酶。试验证明:钙离子浓度的提高是Δ76238菌株能够在葡萄糖为唯一碳源下生产纤维素酶的关键原因。推测Ca2+-H+交换机制Δ76238菌株中发挥的重要作用机制。通过优化培养基的氮源以产生氨来中和酸,可以恢复早期阶段Δ76238的生长,这不会影响晚期放大培养的纤维素酶产生。本章节研究为里氏木霉的纤维素酶产生提供了新的视角,表明纤维素酶在低细胞内pH和Ca2+浓度条件下诱导表达的新机制。3)里氏木霉中新的转录调控因子调控机制研究本研究从SS-Ⅱ基因组重测序的突变基因中筛选获得一个正转录调控因子tre108940。从在葡萄糖抑制条件下培养的里氏木霉RUT-C30的核蛋白中通过pull-down实验和质谱分析分离获得一个负转录调控因子tre47317。这两个转录因子都是真菌特有的Zn（Ⅱ）2Cys6蛋白。通过基因敲除实验,发现tre108940敲除菌株中纤维素酶酶活显著降低,tre108940过表达菌株中纤维素酶酶活显著升高;而tre47317敲除菌株纤维素酶酶活显著升高,tre47317过表达菌株纤维素酶显著降低。对这两个蛋白都进行荧光蛋白质融合表达,分析其细胞定位,发现他们都是核蛋白,定位于细胞核中。通过EMSA分析,这两个转录因子的DNA结合域都可以与纤维素酶基因cbh1的启动子结合,导致探针的凝胶迁移率发生改变。通过进一步DNase I footprinting assay分析,确定tre47317的通用结合位点为5'-（T/A）NNNNCCG-3'和5'-CGGNNNN（T/A）-3',而且负转录调控因子tre47317能调控的纤维素酶基因范围很广。这部分主要获得两个新的转录调控因子,并研究其转录表达调控的机制。4)从宏基因组中挖掘新的糖苷水解酶,并在里氏木霉中异源表达β-葡萄糖苷酶宏基因组是非常好的新酶基因挖掘的来源。这部分主要挖掘了两种新的糖苷水解酶基因,β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶。通过CRISPR-Cas9系统构建大肠杆菌β-半乳糖苷酶lacZ敲除宿主ΔlacZ（DE3）pRARE,用于筛选活性β-半乳糖苷酶。最终筛选到一个性能很好的碱性β-半乳糖苷酶BGal375,活性达到在pH 8和50℃下表现出最大活性,具有很强的糖基转移酶活性,产生的两种GOSs（Galactooligosaccharides,三糖和四糖）的浓度分别达到64.53 g/L和8.32 g/L。对于标准底物,BGal375的Km值为1.65 mM,kcat值为53 s-1。本研究还筛选到一个酶活很高的β-葡萄糖苷酶BGL116,对底物对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPGlu）酶活达到93.2 U/mg,Km值为0.803 mM,kcat值为57.1 s-1。最后,β-葡萄糖苷酶BGL116在里氏木霉RUT-C30成功异源表达,为后续构建里氏木霉异源表达平台和工程菌株提供基础。