文献类型：学位论文

中文题名：适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体的构建及其应用研究

作者：石园园[1];

机构：[1]华东理工大学;

导师：杨胜利;华东理工大学

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：生物催化剂;氧化葡萄糖酸杆菌;基因表达载体;定点突变技术

摘要：氧化葡萄糖酸杆菌（G.oxydans）含有多种膜结合脱氢酶，可不完全氧化多种醇、醛等化合物生成相应的醛、酮和酸，该特性使其作为生物催化剂广泛应用于生物合成工业。利用基因工程手段在G.oxydans中过表达某种脱氢酶基因，可在很大程度上增加单位菌体的催化效率，提高相关产物的产量。然而，目前适用于G.oxydans的基因表达载体的拷贝数普遍较低，这严重限制了它在工业生产中的应用潜力。本课题以普遍用于G.oxydans中基因表达的广宿主质粒pBBR1MCS-5为基础，利用基因定点突变技术构建了6种在G.oxydans DSM2003中拷贝数提高的载体，并用突变后的载体构建了一株高产2-酮基-D-葡萄糖酸(2KGA)的菌株。<br>　　首先，利用基因定点突变技术突变质粒pBBR1MCS-5中与质粒复制相关的rep基因的上游调控区，获得了6种可成功在G.oxydans DSM2003中稳定存在的质粒，命名为pBBR-10、pBBR-35、pBBR-3510、pBBR-RBS、pBBR-R35、pBBR-R31;并运用Q-PCR测定了它们在G.oxydans DSM2003中的拷贝数，发现均比亲本质粒pBBR1MCS-5有不同程度地提高。为了验证这些质粒的应用能力，插入报告基因GFP，发现用这些突变质粒在G.oxydans DSM2003中表达GFP后菌体均有绿色荧光产生，说明这些质粒均可用于在G.oxydans DSM2003中进行基因表达。<br>　　然后，将所获得的6种突变质粒在G.oxydans DSM2003中过表达编码催化葡萄糖酸(GA)生成2KGA的关键酶基因ga2dh，构建高产2KGA的工程菌。通过对过表达菌中ga2dh基因转录水平的测定，以及在摇瓶中催化反应速率的测定，筛选到一株2KGA高产菌G.oxydans/pBBR-3510-ga2dh。7L发酵罐中的转化实验表明，30g/l的G.oxydans/pBBR-3510-ga2dh细胞（湿重）可在17h内将320g/l GA完全转化为约320 g/l的2KGA，时空产率达到18.86g/l/h，为野生菌的2.84倍，为亲本质粒过表达菌的1.60倍。当将底物浓度提高到480 g/l时，30 g/l细胞（湿重）可在45 h内将底物完全消耗，产生约486 g/l的2KGA，时空产率达到10.80g/l/h，超过目前文献报导的最高水平。