文献类型：学位论文

中文题名：来源于Rhodospirillaceae bacterium的新型卤醇脱卤酶的分子改造

作者：陈磊[1];

机构：[1]华东理工大学;

导师：林金萍;华东理工大学|李振海;华东理工大学

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：卤醇脱卤酶;分子改造;分子模拟;1,3-二氯-2-丙醇;(R/S)-2-氯苯乙醇

摘要：卤醇脱卤酶是(HHDH)一类多功能的生物催化剂,可用来合成手性的环氧化物及β-取代醇等化合物。此外,卤醇脱卤酶在环境治理方面,对卤代有机化合物的酶促降解中也起到了主要的作用。目前发现的卤醇脱卤酶的种类越来越多,但是催化性能优异且立体选择性高的HHDH十分有限,极大地限制了卤醇脱卤酶的实际应用。因此,开发催化性能优异且具有应用潜力的卤醇脱卤酶一直是其重点研究方向之一。本论文以来源于Rhodospirillaceae bacterium的新型卤醇脱卤酶HHDH-Ra为研究对象,以脂肪族底物1,3-二氯-2-丙醇(1,3-DCP)和芳香族底物(R/S)-2-氯苯乙醇(2-CPE)为模式底物,通过定向进化和半理性设计等手段,以提高HHDH-Ra对1,3-DCP和(R/S)-2-CPE等底物的催化活性和立体选择性。主要研究结果如下:1.以前期获得的活力提高的HHDH-Ra突变体HHDH-Ra-A138S为研究对象,通过易错PCR方法构建随机突变文库,筛选得到13个对1,3-DCP催化活力提高的突变体,突变体酶活分别为对照酶HHDH-Ra-A138S的1.08-1.89倍。选择催化活力提高最显著的4个突变体(A194T/K201E、R124C、T21A和R73C/M199V)进行组合突变,得到的组合突变体R73C/M199V/T21A和R73C/M199V/R124C的催化活性得到了进一步的提升,分别为对照酶HHDH-Ra-A138S的2.5倍和2.75倍。2.解析获得了高分辨率(1.97(?))的HHDH-Ra晶体结构。在此基础上,首先以突变体Mu-S4(A138S/R73C/M199V/R124C)为模板,通过分子对接、极性/非极性扫描策略和定点饱和突变等方法,得到2个与Mu-S4催化活力和立体选择性相关的突变位点A88和N180。之后以野生型HHDH-Ra为模板,对A88和N180位点进行单点饱和突变,得到5个立体选择性发生了翻转的突变体A88K、A88R、A88M、N180G 和 N180A,另外,突变体 A88N、N180M、N180L、N180C、N180H、N180F、N180Y和N180I的立体选择性相比野生型HHDH-Ra有不同程度的提高,其中突变体N180M催化生成产物(S)-ECH的ee值由野生型的13.11%提高到了 90.54%。通过对突变体N180M的结构分析表明,选择性的提高主要是由于在底物分子内侧C上形成了较大的空间位阻和新的氢键,导致对内侧C原子相连的氯原子的绑定作用变强。3.采用丙氨酸扫描策略和定点饱和突变的方法,对卤醇脱卤酶HHDH-Ra催化底物(R/S)-2-CPE的催化活性和立体选择性进行分子改造,获得了 2个对S-2-CPE活性显著提高的突变体N180A和N180G,酶活分别是野生型HHDH-Ra的9.5和15倍,且突变体N180G催化S-2-CPE合成产物(S)-SO的ee值由野生型HHDH-Ra的89.11%提高到了 99.9%以上。将突变体N180A和N180G用于(R,S)-2-CPE的动力学拆分反应,产物(S)-SO的eep值分别达到91%和97.17%,对映体选择率(E值)分别由野生型HHDH-Ra的1.51显著提高到71.51(N180A)和278(N180G)。通过对突变体N180A和N180M的结构分析表明,活性的提高是由于酶与底物的结合作用力增强且Tyr149作用底物羟基的脱质子过程更容易发生,而选择性的提高是由于产生了空间位阻效应,使活性催化口袋中底物苯环摆向的角度改变。