文献类型：学位论文

中文题名：合成手性环氧化物生物催化剂的挖掘改造及催化工艺研究

作者：吴锴[1];

机构：[1]华东理工大学;

导师：杨胜利;华东理工大学|魏东芝;华东理工大学

授予学位：博士

语种：中文

中文关键词：手性环氧化物;生物催化剂;数据挖掘;水解酶;酶学性质

摘要：手性环氧化物是非常重要的精细化工中间体。由于三元环内部张力的存在和C-O键的极化作用，环氧化物是一类非常易于与各类亲核试剂发生反应的分子，所以环氧化物能够衍生出其他很多非常重要的手性分子。本研究围绕手性环氧化物的酶法制备展开，从酶的发掘、定向改造和反应工艺优化三个方面进行了研究和创新。本论文涉及两类环氧化物:氧化苯乙烯(Styrene Oxide，SO)和苯基缩水甘油醚(Phenyl Glycidyl Ether, PGE);两种酶:环氧水解酶(Epoxide Hydrolase，EH)和酮还原酶或称醇脱氢酶(Alcohol Dehydrogenase，ADH);两种催化过程:外消旋环氧化物动力学拆分和不对称还原后的手性卤醇闭环环氧化。具体内容如下:<br>　　第一部分，环氧水解酶酶库建立与新酶筛选。通过基因组数据挖掘异源表达了69个未经鉴定的全新环氧水解酶，成功筛选到27个对SO或PGE有活性的EHs。其中，EH785对SO具有一定选择性，以30％的得率得到＞98％ ee的(R)-SO。EH7131对SO和4-氯SO具有对映体汇聚的特性，能够以88％的得率得到83％ ee的(R）-苯基乙二醇，以100％的得率得到88％ ee的(R)-4-氯苯基乙二醇。EH448113对PGE具有R选择性，水解R构型PGE，能够以33％的得率制备ee＞99％的(S)-PGE。以上结果表明从公开基因组数据发掘生物催化剂是非常可行的策略。<br>　　其中，来自Tsukamurella paurometabola的EH201623(TpEH)具有对PGE已知最高的立体选择性(E=65)，选择性与EH448113相反，能够以45％的得率制备ee＞99％的(R)-PGE。对TpEH进行了酶学性质鉴定，确定其最适温度和pH后测定其比活为39U/mg。TpEH除了以高E值拆分PGE，对间甲基PGE的E值达到52，对间硝基PGE的E值＞100。除了很高的选择性，TpEH能够以10 mg/ml的冻干菌体在1h内完成400 mM的PGE拆分，时空产率达到30g/L/h，是目前EH制备手性PGE的最高浓度。通过发酵，TpEH重组菌体可以大量制备，使用该菌体，我们成功进行了(R)-PGE和(R）-3-甲基PGE的克级制备。该过程的高选择性和高时空产率使TpEH展现出了极大的应用潜力。至此，通过TpEH与EH448113的动力学拆分过程， ee＞99％的(R)-PGE和(S)-PGE得到成功制备。<br>　　第二部分，酶-化学制备手性环氧化物方法的建立和优化。由于动力学拆分有50％的理论得率限制，我们发展了酮还原酶参与的酶-化学法制备手性环氧化物路线。利用酮还原酶还原卤代酮100％转化率和高选择性的特点，先制得手性纯的卤醇，再加入过量的强碱后，手性卤醇可以闭环转化为环氧化物并保持其ee值。我们克隆表达了来自Kuraishia capsulate CBS1993的新型酮还原酶(KcDH)，并对其进行了酶学鉴定。通过对KcDH还原活力和氧化活力的动力学参数测定，确定该酶能够利用异丙醇作为共底物参与辅酶循环。KcDH对25个芳香酮底物表现出ee＞99％的选择性，展现出及其广泛的底物谱。该酶对α-氯代苯乙酮和3-氯-1-苯氧基-2-丙酮表现出极高的选择性，对应的产物卤醇ee＞99％，通过优化NaOH投量和反应时间，我们成功使用该酶化学法制备了(R)-SO和(S)-PGE。(R)-SO分析得率达86％，ee＞99％。(S)-PGE分析得率达94％，ee＞99％。至此，合成手性环氧化物的酶化学法初步建立。与动力学拆分相比，该酶化学法在得率上展现出显著的优势，但是受限于KcDH的稳定性和有机耐受性，产物浓度无法进一步提高。<br>　　为解决上述问题，我们使用来自Lactobacillus kefir的高选择性高底物耐受的酮还原酶(LkDH)，将不对称还原步骤的底物浓度提高到1M并应用于上述酶化学法成功得到了ee＞99％的(S)-SO，得率78％。由于副产物苯基乙二醇的存在，目标产物手性SO的得率不能进一步提高。通过向反应体系中添加有机相，成功避免了酶化学法第二步碱闭环过程中的副产物产生，最终选定甲基叔丁基醚，将制备(S)-SO的分析得率提高到＞99％。<br>　　第三部分，半理性定向进化改造酮还原酶选择性。为能够高浓度制备另一手性纯的对映体(R)-SO，我们采取活性口袋的迭代饱和突变策略，半理性地定向进化LkDH并成功翻转其选择性。通过结构信息合理地选择突变位点，经过三轮饱和突变文库的筛选，成功得到了一个7点突变体F147L/Y190P/A202F/M206H/V196L/S96D/K97V(muDH2)，该突变体表现出与野生型完全相反的选择性，产生(R）-α-氯代苯乙醇，ee值达到99.1％。通过柔性分子对接，我们将底物分别对接进野生型和muDH2并分析其结合模式。对接结果显示出底物在二者活性口袋中完全相反的结合方向，根据预测酮还原酶选择性的Prelog规则，辅酶分别从不同的面攻击野生型和muDH2中的底物，导致产生完全相反立体构型的产物，在理论上对选择性的翻转给予了解释。最后，我们使用选择性相反的muDH2及LkDH野生型，成功在100ml反应体积下使用上述优化过的酶化学法，分别制备了ee97.8％的(S)-SO和ee98.1％的(R)-SO，产物浓度达到120g/L，分离得率分别达到80.3％和82.1％。