文献类型：学位论文

中文题名：从螺甾皂苷元到变形螺甾皂苷元的微生物转化：Streptomyces virginiae IBL-14中催化薯蓣皂酮生成异扭替皂酮的细胞色素P450单加氧酶的鉴定和克隆

作者：王玮[1];

机构：[1]华东理工大学;

导师：魏东芝;华东理工大学

授予学位：博士

语种：中文

中文关键词：变形螺甾皂苷;微生物转化;薯蓣皂酮;异扭替皂酮;细胞色素;P450基因;基因鉴定;基因克隆

摘要：甾体皂苷是植物中普遍存在的化合物，它们具有很多重要的生理活性，如抗癌、调节免疫功能、防治心血管疾病、降血糖、抗真菌等，有些已应用于临床。变形螺甾皂苷是其中一种非常稀有的甾体皂苷，生物活性长期不为所知。近年来，对甾体皂苷生物学活性认识和研究的逐渐加深，变形螺甾皂苷由于其特异的结构和性质受到格外重视。但是由于天然变形螺甾皂苷的含量极低，植物中类似物多，分离纯化工艺复杂，难以大量制备，化学法人工合成又十分困难，因此难以进行细致的功能研究和应用开发。国内外迄今对其进行的研究仅限于各种变形螺甾皂苷的分离和新结构的鉴定。 本课题的前期工作(研究甾体皂苷生物转化法结构改造过程)中，我们发现一些微生物可实现螺甾皂苷元到变形螺甾皂苷元的转化，并筛选到一株链霉菌Streptomyces virgniniae IBL-14，该菌可将薯蓣皂苷元氧化成薯蓣皂酮，再将后者的F-环C-25位羟基化，而转化生成异扭替皂酮。异扭替皂酮在酸性条件下，可经亲核重排生成扭替皂酮。薯蓣皂苷元和薯蓣皂酮为常见的螺甾皂苷元，而(异)扭替皂酮为新化合物，其类似物扭替皂苷(元)为一种稀有的天然产物，具有抗肿瘤、降血脂等重要活性。S.virgniniae IBL-14转化薯蓣皂苷元生成(异)扭替皂酮，第一次实现了螺甾皂菅元到变形螺甾皂苷元的微生物转化法制备，该方法的发现为大量制备变形螺甾皂苷元类化合物，特别是(异)扭替皂酮类化合物，提供了一条简便可行的方法。 本课题试图寻找到S.virgniniae IBL-14中可以实现螺甾皂苷元到变形螺甾皂苷元的生物转化的功能基因，希望为将来能够代替原有的分离纯化工艺，实现变形螺甾皂苷元的大量生产以及为保护自然环境和植物资源提供一些潜在的应用价值。基于以上考虑，本论文主要做了以下工作。 1.功能酶克隆的初步研究 通过P450抑制剂和P450电子传递链加强实验得知，负责薯蓣皂酮C-25位羟基化反应酶的的活性可以被P450特征抑制剂所抑制，也可以随P450酶电子传递链体系电子传递能力的增强而增强。此结果可以充分说明，未知的C-25位羟化酶是细胞色素P450单加氧酶(简称P450或CYP)。以链霉菌P450酶的氧气结合区和血红素结合区的保守氨基酸序列设计九个兼并引物进行PCR扩增，以链霉菌属中与次级代谢相关的P450基因序列设计三十对特异引物进行PCR扩增，共从S.virginiae IBL-14基因组中克隆到十个新的P450基因。 2.功能酶基因的确定和动力学研究 通过单交换基因重组技术，逐个中断发现的十个新P450基因，发现P450fcpC基因功能的中断突变株失去转化薯蓣皂酮生成异扭替皂酮的能力，因而P450fcpC可能是负责此生物反应的酶。接着通过双交换重组基因同框缺失，基因回补实验和异源表达实验确证：P450fcpC就是催化薯蓣皂酮生成异扭替皂酮反应的羟化酶基因。通过大肠杆菌异源表达和Ni柱亲和层析纯化了P450fcpC酶分子蛋白；用纯化后的酶蛋白进行体外转化实验，并初步研究了薯蓣皂酮到异扭替皂酮转化反应的动力学过程，计算出此步催化反应的Km为2.4μM，Vmax为0.024μmol/min/mg，反应的转换数kcar为1.06 min-1。 3.基因工程大肠杆菌全细胞转化体系的研究 通过分析fcpC基因，知道其属于细菌三组分协同作用的I型电子传递链P450系统，下游编码序列fcpD为其原生铁氧还蛋白。利用天蓝色链霉菌中的铁氧还蛋白还原酶在大肠杆菌中完成P450fcpC的完整电子传递链体系，发现SC4810对fcpC体系的还原能力最好。共表达SC4810、fcpD和fcpC的基因工程大肠杆菌的全细胞催化体系，实现薯蓣皂酮到异扭替皂酮的转变。在本研究条件下，产物生成率最高可达5％，并为将来应用基因工程菌株大量生产异扭替皂酮提供了可行性。同时，P450fcpC全细胞转化体系也可以催化L-薄荷醇生成7-羟基-L-薄荷醇。 综上所述，本论文描述了从S.virginiae IBL-14中鉴定出催化螺甾皂苷元转化生成变形螺甾皂苷元的P450酶fcpC，从而揭示了一种新的甾体皂苷微生物转化机制，有助于甾体皂苷药物的结构改造研究，为稀有变形螺甾皂苷元类化合物及甾体药物新颖衍生物的制备提供了有力的手段。