文献类型：学位论文

中文题名：基于启动序列替换提高L-鸟氨酸产量的研究

作者：任立泉[1];

机构：[1]华东理工大学;

导师：周英;华东理工大学

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：谷氨酸棒杆菌;启动序列;蛋白质组学;L-鸟氨酸;酯酶;理性设计

摘要：L-鸟氨酸是一种非必需氨基酸,在食品和医药等领域有广泛的应用。谷氨酸棒杆菌是L-鸟氨酸的常用生产菌株。N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸脱氢酶(argC)在谷氨酸棒杆菌中是L-鸟氨酸生物合成途径中argCJBD基因簇的第一个酶。过表达argC可增强L-鸟氨酸末端生物合成途径,从而提高L-鸟氨酸生物合成途径的流量,使L-鸟氨酸大量积累、产量提高。谷氨酸棒杆菌野生菌株的L-鸟氨酸产量为8.86±0.15 g·L-1,在替换高强度启动序列后,L-鸟氨酸产量达10.50±0.03 g·L-1,为野生型的118%,产量提升明显。本研究将谷氨酸棒杆菌S9114菌株发酵培养12 h的样品进行蛋白质组学分析,以其丰度值作为内源性启动序列的筛选依据,筛选获得16个不同强度的启动序列。将其连接增强型绿色荧光蛋白并在谷氨酸棒杆菌中进行表达。经过对荧光强度进行测定发现,荧光强度值分布在52.0 RFU/OD到5966.8 RFU/OD中,变化范围超过100倍,其中最强启动序列的启动强度为Ptac启动子的3.3倍。选择其中8个启动序列替换argC基因的启动序列并将替换菌株进行发酵培养和产量测定,结果发现随启动强度的增加L-鸟氨酸产量从0.87±0.04 g·L-1增加至10.50±0.03 g·L-1,即产量随argCJBD基因簇表达量的提高而提高。最强的PC624 05210启动序列的替换菌株的L-鸟氨酸产量是野生型的118%。本实验从谷氨酸棒杆菌S9114中筛选并验证了 16个不同强度的启动序列,为谷氨酸棒杆菌的代谢调控提供了丰富的控制元件,也为L-鸟氨酸的增产打下了坚实的基础。酶的理性设计可以使用数个碱基的突变带来酶性质的巨大改变,这种对基因组修饰极少即可控制代谢的方法在代谢工程方面有很广阔的应用前景。为了给后续的改造奠定方法基础,本研究开展了酶的理性设计工作。通过计算机辅助的模拟筛选和人工筛选,得到两个酶活分别提高2.5和2.1倍的突变体。通过结构分析发现,突变削弱了催化位点上方盖状结构的密封能力,使催化中心露出从而导致催化效率变高。该实验为酶的改造提供了新的设计策略。