文献类型：学位论文

中文题名：脱乙酰基酯酶的重组表达、固定化及其性能研究

作者：朱颖[1];

机构：[1]华东理工大学;

导师：杨胜利;华东理工大学|魏东芝;华东理工大学

授予学位：硕士

语种：中文

中文关键词：头孢菌素C;脱乙酰基酯酶;固定化;重组表达;发酵策略

摘要：头孢菌素C脱乙酰基酯酶(CAH)[EC3.1.1.41]是一种能够催化头孢菌素C(CPC)或7-氨基头孢烷酸(7-ACA)3'位置乙酰基水解的酯酶。CPC或7-ACA脱掉乙酰基后可以作为前体，用于合成各种半合成头孢菌素类抗生素，如头孢氨呋肟、头孢西丁、头孢泊肟酯等。本课题旨在通过对表达质粒、发酵策略的系统优化实现枯草芽孢杆菌来源的CAH在大肠杆菌系统中的高水平表达，并通过固定化条件的优化，获得高活力的固定化CAH制剂。 课题构建了8种诱导型质粒和16种组成型质粒试图实现CAH基因的高效异源表达。经过筛选，最终选择带有pUC19上的起始位点、SIL3基因、Trp启动子以及间隔序列为B1的组成型表达质粒pB1-SIL3-K为最佳表达质粒。将组成型质粒PB1-SIL3-K转化大肠杆菌DH5α，37℃发酵培养24h，其酶活可以达到了144U/mL。 为了提升重组CAH的表达水平，降低生产成本，课题进一步研究了影响发酵的各个因素，对接种种龄、发酵培养基的组成和发酵条件进行了优化。确定摇瓶发酵培养基的最佳组份配比是:2％白糊精，2％安琪酵母粉，2％的鱼骨蛋白胨和1×M9基础盐。优化后，摇瓶发酵CAH的最高酶活单位可达到420U/mL。进一步通过控制pH值和补加4％甘油在7L发酵罐上放大培养，24小时后CAH最高酶活达到1340U/mL，此表达水平为目前国内外文献报道的最高水平。 利用氨基载体HA和环氧基载体EP对CAH进行了固定化研究。通过对固定化条件的优化，成功地制备了CAH的两种固定化酶，其单位酶活均超越目前商品化酶。固定化酶比游离酶拥有更宽的pH稳定范围和温度稳定范围，其最适温度和pH值分别为60-65℃与8.0-8.5。